01微生物检测的项目及参考标准

1.1 卫生指标限度要求

根据进口饲料和饲料添加剂登记管理办法规定，申请进口登记的饲料、饲料添加剂，应当符合生产地和中国的相关法律法规、技术规范的要求。目前，我国关于饲料及饲料添加剂的强制规定及标准有《饲料卫生标准》和宠物饲料卫生规定。详细检测项目及限量见表1和表2。

1.2 功能性微生物

我国《饲料添加剂品种目录》中有34种微生物可用于饲料和动物养殖，常用于畜含及水产品养殖的微生态制剂有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母，以及它们混合后的饲料添加剂。

02微生物检测的常见方法

我国部分微生态制剂检测标准见表3。

2.1 平板菌落计数法

平板菌落计数法是定量检测中最常使用的方法。平板菌落计数法分为两种，一种为涂布法，一种为倾倒法。平板菌落计数法能准确的检测出样本中的菌落个数，但是平板菌落法费时、费力，且操作繁杂。

2.2 MPN法

MPN法，也称作最有可能数法，是根据统计学理论，估计样本中微生物数量的一种方法，MPN法检测出的数值，并不代表细菌的实际菌落数。

2.3 显微镜计数法

显微镜计数法是利用血球计数板对微生物活菌数进行菌落计数，具有操作简单、耗时短、成本低等特点。但用显微镜计数法检测时，细菌的死活不易区分，数值容易出现误差。

2.4 滤膜法

滤膜法是指将样品经微孔滤膜过滤后，将微孔滤膜置于培养基中培养，从而得到样品中的菌落数目，此方法操作简单、便捷，但是检测精度不足，应用范围小。

2.5 PCR法

PCR法多用于定性检测，可以通过对细菌的DNA或RNA片段进行扩增，检测其扩增片段完成微生物种类的确证。PCR法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、纯度要求低等优点，但也存在一些假阴性、假阳性等问题。

03微生物检测常见问题及建议

3.1 细菌总数

进口饲料及饲料添加剂检测过程中，培养后的琼脂表面会生成一层膜，这是因为实验过程中，营养琼脂和稀释液混合均匀后，营养琼脂还未冷却就将平皿盖盖上，水汽挥发不出去，造成水汽过大。导致细菌在琼脂表面蔓延生长，形成一层“膜”。

细菌总数在结果计数时，营养琼脂表面菌落有时结片，一是细菌本身的菌落形态较大，二是因为培养基的水汽过大，造成细菌蔓延生长。在做细菌总数检测时，尤其是鱼粉等细菌总数偏高的这一类产品，建议在平皿培养第二天进行第一次计数作为参考，第三天再做最终计数。

3.2 霉菌总数

霉菌在培养7d后，菌落基本都比较大甚至还会长出菌丝和孢子，连成一片。虽然国标13092中规定霉菌总数的计数范围是每平板10~100，但在实际检测过程中，若一个琼脂板上生长70个霉菌培养7d靠肉眼无法分辨每一个菌落。在检测进口饲料和饲料添加剂过程中，要严格按照标准要求，从第四天开始，每天计数，每天记录。

做霉菌总数计数时，培养后的琼脂板要平移，不要倒置，也不要振动，防止孢子脱落，污染环境，危害人类健康。

3.3 大肠菌群

国标18869中，检测大肠菌群有两种方法一是乳糖胆盐发酵法，二是LST发酵法。在实际检测过程中，两种方法的选择是有区别的。乳糖胆盐法检测耗时相对短，LST发酵法步骤少，但这两种方法最大的差异，是乳糖胆盐发酵法的限量要求是每100g(mL)，LST发酵法的限量要求是每g/mL。实际进口饲料和饲料添加剂检测过程中，应根据实际情况，选择检测方法。

在培养基配制时，每个培养基试管内都需要放置倒置管，为节约实验时间，可以直接把空的倒置管放在试管内，然后分装液体培养基，通过高压灭菌并冷却后，倒置管内的气体会自动排空。在大肠菌群检测过程中，培养基试管不可剧烈振动，向试管内添加样品稀释液的时候也不要注射过快，避免使倒置管内产生气泡，造成假阳性。

3.4 沙门氏菌

标准菌株是做进口饲料和饲料添加剂微生物定性检测必不可少的，在使用过程中，要时刻关注标准菌株的菌落形态，有污染和退化的现象时，要及时分离纯化、复壮，必要时更换。在沙门氏菌检测过程中，除了要比对标准菌株的菌落形态，还要根据以往的经验判断是否为沙门氏菌阳性。

实验表明，不同厂家的培养基对沙门氏菌的检出有很大的影响，韩镌竹(2016)实验表明BPW对沙门氏菌的检出率影响很大。在更换培养基时，要对新的培养基做验证，确实有效后，方可投入使用。

3.5 功能性微生物

几种常见混合型微生态制剂的检测方法见表4。

检测微生态制剂功能性菌，不能根据菌落的典型特征确定细菌种类，一定要做生化鉴别确定细菌种类。

芽孢杆菌中还有孢子，容易对环境及其他的产品造成污染，且不宜除去，在检测过程中，涉及芽孢杆菌的微生态制剂，应使用单独的耗材，如有条件，可使用一次性耗材。

采用涂布法进行细菌菌落总数测定时，琼脂板的制备特别关键，平板的制备时间要控制好例如孟加拉红琼脂板要多放置一段时间，使琼脂表面的水分挥发，有利于样品稀释液的吸收；PDA琼脂培养基水分挥发快，需要及时收起来不然平皿表面水分低，样品稀释液未涂布均匀就被琼脂吸收了。

进口饲料添加剂的某些功能菌检测条件为厌氧，实验室可以配备厌氧培养箱，也可以配备厌氧罐和厌氧包，厌氧包在投入使用前要经过严格的筛查。

来源：宠物食品联盟